I prudutti

Per quantificà specificamente parechji metaboliti di 5-fluorouracil (5-FU) è dui nucleotidi monofosfati endogeni, avemu sviluppatu un metudu originale basatu nantu à una cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).Stu analisi hà permessu di a determinazione di: (i) a produzzione intracellulare di 5-fluoro-2′-deoxyuridine-5′-monofosfatu (5-FdUMP) da 5-FU o 5-fluoro-2′-deoxyuridine (5-FdUrd) , (ii) l'impattu di a cuncentrazione di 5-FdUMP nantu à u rapportu intracellulare 2′-deoxyuridine-5′-monophosphate (dUMP) / timidine-5′-monophosphate (TMP), è (iii) l'estensione di secrezione di 5-FdUMP è 5-FU da cellule umane coltivate da trasportatori ABC.In e nostre cundizioni sperimentali, e cellule sò state incubate cù 5-FU o 5-FUrd.Allora, i proteini cellulari sò stati precipitati da metanolu.Questa prucedura hà furnitu una ricuperazione d'estrazione alta.Inoltre, per misurà a secrezione di 5-FU è 5-FdUMP da e cellule, avemu fattu a quantificazione di sti molécule in un mediu di cultura.I media sò stati iniettati direttamente (5-FU) o sottumessi à un'estrazione in fase solida cù a cartuccia di estrazione Oasis Wax (5-FdUMP).A separazione di analiti hè stata realizata nantu à una colonna dC18 Atlantis 3.5 μm, (100 mm × 2.1 mm id) cù modalità isocratica utilizendu un buffer di formatu d'ammoniu / metanol / acqua (5/5/90, v / v) cum'è fase mobile.U tempu di esecuzione ùn superava 6,2 min.L'analiti sò stati ionizzati in una interfaccia elettrospray in modu di ioni negativi.Avemu validatu u metudu nantu à una gamma di 2.5-150 ng mL -1 secondu i composti.A variabilità intra-e inter-assay era più bassa di 10% in sette ghjorni.Tutti i composti sò stati stabili in cellule o in u mediu di cultura quandu i campioni sò stati guardati à -20 ° C per almenu duie simane, è dopu trè cicli di congelazione-discongelu.Nisun effettu di matrice hè statu osservatu in i dui media.