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L'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) hè un analogu di u substratu di β-galactosidase, chì hè assai inducible.Sottu à l'induzione di IPTG, l'induttore pò furmà un cumplessu cù a proteina repressore, Per quessa, a conformazione di a proteina repressore hè cambiata, perchè ùn pò micca esse cumminata cù u genu di destinazione, è u genu di destinazione hè spressione efficacemente.Allora cumu si deve esse determinata a cuncentrazione di IPTG durante l'esperimentu?Hè u più grande u megliu?
Prima, capiscenu u principiu di l'induzione IPTG: l'operonu di lattose di E. coli (elementu) cuntene trè geni strutturali, Z, Y è A, chì codificanu β-galactosidase, permeasi è acetyltransferase, rispettivamente.lacZ hydrolyzes lactose in glucose è galactose, o in allo-lactose;lacY permette à lactose in l'ambienti di passà per a membrana cellulare è entra in a cellula;lacA trasferisce u gruppu acetyl da acetil-CoA à β-galactoside, chì implica l'eliminazione di l'effettu tossicu.Inoltre, ci hè una sequenza operativa O, una sequenza iniziale P è un genu regulatori I. U codice di u gene I hè una proteina repressore chì pò ligà à a pusizione O di a sequenza di l'operatore, perchè l'operone (meta) hè riprimutu è spenta.Ci hè ancu un situ di ubligatoriu per u situ di ubligatoriu di a proteina-CAP attivatore di genu catabolicu upstream di a sequenza iniziale P. A sequenza P, a sequenza O è u situ di ubligatoriu CAP inseme custituiscenu a regione regulatoria di l'operone lac.I geni codificanti di e trè enzimi sò regulati da a listessa regione regulatoria per ottene l'espressione coordinata di i prudutti di geni.

In l'absenza di lactosa, l'operonu lac (meta) hè in un statu di ripressione.À questu tempu, u repressor lac spressu da a sequenza I sottu u cuntrollu di a sequenza di u promotore PI s'unisce à a sequenza O, chì impedisce à a polimerasi di RNA da unisce à a sequenza P è impedisce l'iniziu di a trascrizzione;quandu a lattosa hè prisente, l'operonu di lac (meta) pò esse induce In questu sistema di l'operu (meta), u veru induttore ùn hè micca a lactosa stessu.Le lactose pénètre dans la cellule et est catalysé par la β-galactosidase pour être converti en allolactose.L'ultime, cum'è una molecula inductrice, si unisce à a proteina repressore è cambia a conformazione di a proteina, chì porta à a dissociazione di a proteina repressor da a sequenza O è a trascrizzione.Isopropylthiogalactoside (IPTG) hà u listessu effettu cum'è allolactose.Hè un induttore assai putente, chì ùn hè micca metabolizatu da i batteri è hè assai stabile, per quessa hè largamente utilizatu in i laboratorii.

Cumu determinà a cuncentrazione ottima di IPTG?Pigliate E. coli per esempiu.
A ceppa E. coli BL21 genetically engineered chì cuntene u pGEX recombinante pusitivu (CGRP / msCT) hè stata inoculata in un mediu liquidu LB chì cuntene 50μg · mL-1 Amp, è cultivatu per a notte à 37 ° C.A cultura sopra hè stata inoculata in 10 buttigli di 50mL frescu di mediu liquidu LB chì cuntene 50μg · mL-1 Amp à un rapportu di 1: 100 per a cultura di espansione, è quandu u valore OD600 era 0,6 ~ 0,8, IPTG hè aghjuntu à a cuncentrazione finale.Hè 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Dopu a induzione à a listessa temperatura è à u stessu tempu, 1 mL di a suluzione bacteriana hè stata presa da ellu, è e cellule battìriche sò state cullate da centrifugazione è sottumessi à SDS-PAGE per analizà l'influenza di e diverse concentrazioni IPTG nantu à l'espressione di prutezione, è dopu. selezziunà a cuncentrazione IPTG cù a più grande espressione di prutezione.
Dopu l'esperimenti, si trova chì a cuncentrazione di IPTG ùn hè micca quant'è pussibule.Questu hè chì l'IPTG hà una certa toxicità à i batteri.Superà a cuncentrazione ancu tumbà a cellula;è in generale, speremu chì a proteina più soluble espressa in a cellula, u megliu, ma in parechji casi, quandu a cuncintrazione di IPTG hè troppu alta, serà furmatu una grande quantità di inclusi.Corpu, ma a quantità di proteina sulubbili diminuì.Dunque, a cuncentrazione IPTG più adatta hè spessu micca u più grande u megliu, ma u più bassu a cuncentrazione.
U scopu di l'induzione è u cultivo di ceppi geneticamente ingegneriali hè di aumentà u rendiment di a proteina di destinazione è di riduce i costi.L'espressione di u genu di destinazione ùn hè micca solu affettata da i fatturi di a ceppa è u plasmide d'espressione, ma ancu da altre cundizioni esterne, cum'è a cuncentrazione di l'induttore, a temperatura di induzione è u tempu d'induzione.Dunque, in generale, prima chì una proteina scunnisciuta sia espressa è purificata, hè megliu studià u tempu d'induzione, a temperatura è a cuncentrazione IPTG per selezziunà e cundizioni adatti è ottene u megliu risultati spirimintali.